刚刚，华裔科学家刘如谦团队再发Nature：迈向AI蛋白质工程通用范式

最近，刘如谦团队又在Nature上发了一篇新文章。这次他们玩了个组合拳：先用AI（ProteinMPNN）把天然蛋白酶重新设计一遍，让它变得更稳定、表达更高，然后拿这个AI设计版作为起点，用实验室连续进化（PACE）去逼它切割原本不认识的靶点。结果呢？还真搞出了针对非天然靶点、同时兼具高稳定性、高催化效率和高特异性的蛋白酶。

论文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-026-10820-0

具体来说，他们先用AI模型ProteinMPNN对天然蛋白酶进行序列重设计——保留识别和催化必需的关键残基，其他位置让AI自由发挥，再用AlphaFold2评估结构。得到一批更稳定的变体后，再把这些AI设计变体和天然酶一起，放到PACE系统里并行进化，看谁能更快学会切割新底物。结果很有意思：基于AI设计的BoNT/E不仅保留了新底物特异性，还大幅提升了表达、稳定性和可进化性；修复了PTEN靶向变体原有的稳定性问题；甚至还进化出了高特异性的ataxin-2靶向蛋白酶。

这种“先AI设计稳住骨架，再定向进化折腾功能”的思路，对整个蛋白质工程领域都有启发。它可能成为未来开发新酶、新型治疗蛋白乃至其他功能蛋白的通用范式。

AI发现了新进化起点

以往做定向进化，大家通常直接拿天然酶开刀。但天然酶稳定性有限，经不起太多折腾；而经过人工改造或实验室进化得到的蛋白，又常常面临稳定性、活性或特异性不够的尴尬。

刘如谦团队的做法是：别急着从天然酶开始，先让AI算出一个更稳定、表达更高的版本，再把这个计算设计版本作为自动化连续进化的起点。流程大致分两步：

1. 计算设计：获得稳定化BoNT蛋白酶

他们以BoNT/E为模型，用ProteinMPNN重新设计序列，保留底物识别和催化关键残基，其他位置由AI重新生成，然后用AlphaFold2评估结构。对AI设计变体进行表达、纯化和活性测试后发现，多数变体都能切割天然底物SNAP25，其中D1、D2和D3三个变体表现最突出，最高催化效率达到野生酶的2.8倍。

为了排除模型依赖，他们还用PROSS重新设计了BoNT/E，同样获得表达、稳定性和酶动力学改善的变体。把这套流程拓展到BoNT/F和BoNT/X，结果也类似——保留或提高了催化效率。

2. PACE进化：获得新底物切割能力

拿到稳定化变体后，他们比较了AI设计变体D3与天然酶作为进化起点的优劣。让两类起点分别适应三个越来越难切割的新底物（415、413、412），用PACE持续筛选更高效的变体。结果很明确：AI设计变体在每个新底物上都获得了更高活性，尤其在最难底物412上，成功率完胜。突变互换实验还揭示了一个关键点：部分有益突变只在AI设计背景下有效，放到天然酶里就不灵了。

随后，他们尝试让BoNT/E去切割一个与神经退行性疾病相关的蛋白——ataxin-2。从天然酶和AI设计蛋白酶分别出发，用PACE筛选ataxin-2切割变体，并通过酶学和细胞实验验证活性与选择性。

图｜计算蛋白质序列设计与连续进化整合流程概览，以及稳定化 BoNT/E 蛋白酶的重新设计。

比“天然酶”更好

整体来看， AI设计版的蛋白酶在保留新底物特异性的同时，表达水平、稳定性和可进化性都上了一个台阶。具体结果如下：

1. 改善已有进化蛋白酶

AI重新设计可以直接提升已有进化酶的表达和稳定性。之前有个PTEN切割变体E(4130)A2，表达低、稳定性差，是个老大难。研究团队把它的进化突变移植到AI设计变体D1、D2和D3中，结果新蛋白酶既保留了PTEN切割能力，又不会重新切割天然底物SNAP25。表达水平更是大幅提升：在大肠杆菌中提高了2.2到5.2倍，在HEK293T细胞中，D2和D3变体表达量提高超过24倍，PTEN切割产物分别增加4.5倍和3.9倍。

图｜将PACE进化得到的BoNT/E突变与ProteinMPNN重新设计结合，可提高重新编程PTEN切割型BoNT/E蛋白酶变体的表达水平和活性。

2. 提升新底物进化效果

AI设计起点在新底物进化中表现更优。比较D3和天然BoNT/E在三个新底物上的PACE结果，D3更容易进化出高活性变体，稳定化设计明显改善了后续进化效果。最难的底物412上，天然酶四组实验只有两组成功，而D3四组全部成功；D3变体的PACE回路激活达到16到20倍，天然酶变体只有约10倍。突变互换实验再次确认：部分有益突变只在AI设计背景下有效。

3. 扩展蛋白酶进化空间

重新设计起点让蛋白酶有机会获得完全不同于天然酶的突变组合。以底物413为例，D3在进化过程中富集了一些天然酶中很少见的突变组合，说明AI设计后的蛋白酶可以探索不同的功能序列空间。

图｜基因型分布，以及中等难度进化过程中起始点特异性突变组合的变化。

为了验证其他设计蛋白酶是否也能作为有效起点，他们测试了ProteinMPNN设计变体D4和PROSS设计变体PROSS1。结果显示，D4和PROSS1都能在三个新底物上通过PACE选择，并形成不同于天然酶和D3的进化基因型。其中D4的初始催化速度虽然比天然酶低约20倍，但进化后仍获得了与其他设计起点相当甚至更高的活性。总体来看，三种重新设计起点产生的进化变体，活性都优于天然酶起点。

图｜替代重新设计起点的进化，以及对进化基因型在所有起始背景中功能的综合评估。

4. 进化ataxin-2靶向蛋白酶

序列重新设计起点产生了更快、特异性更强的ataxin-2切割变体。ataxin-2是一种与神经退行性疾病相关的蛋白，BoNT/E原本不会切割它。他们选择其1181-1201位残基作为新切割区域（这一区域与异常蛋白聚集有关）。相比从天然酶出发得到的变体，D3进化变体切割ataxin-2的速度提高了1.4到1.7倍，同时完全检测不到对天然底物SNAP25的切割。在HEK293T细胞中，序列重新设计起点得到的变体表达更高，产生的ataxin-2切割产物更多，副产物也更少。

图｜将序列重新设计蛋白酶与野生型蛋白酶分别重新编程，使其优先切割治疗相关的非天然靶标，而非天然靶标。

还有一些不足

当然，这套方法虽然前景不错，但研究团队自己也指出了几个需要进一步验证的地方：

第一，目前主要是在BoNT/E蛋白酶上验证的。这类蛋白酶恰好适合通过序列重新设计提高稳定性，而且功能也能在PACE中被选择。其他蛋白是否也能享受同样的红利，还需要更多数据说话。

第二，ataxin-2靶向蛋白酶目前还处于工具酶和早期应用验证阶段。用它来在蛋白水平上破坏致病性ataxin-2包涵体，到底能不能改善神经退行性疾病相关表型，还有待后续研究去回答。

第三，安全性是绕不开的问题。尤其是切割非天然靶标时，除了提高目标切割效率，未来还需要尽可能减少对天然底物的切割，并系统评估潜在脱靶效应、细胞毒性、递送方式和免疫安全性。

更多技术细节，详见原论文。